癌細胞通過操縱正常的生物學過程促使自身不斷增殖。神經系統(tǒng)在癌癥調節(jié)中的作用越來越受到重視。腦源性神經營養(yǎng)因子BDNF（brain-derived neurotrophic factor）是大腦中神經元突觸可塑性的關鍵介質，它對神經元的形態(tài)和生理功能發(fā)揮至關重要，可促進神經元生長以及大腦神經細胞突觸的形成和穩(wěn)定。

近期來自斯坦福大學神經學科的研究者們在《Nature》上發(fā)表了題為“Glioma synapses recruit mechanisms of adaptive plasticity”的文章，這一突破性的研究發(fā)現(xiàn)膠質瘤通過BDNF使用神經元活動，這一舉動與健康腦細胞相同：BDNF由神經元傳至腫瘤細胞，激發(fā)細胞內部連鎖反應，助力腫瘤形成更加復雜和強大的突觸網絡。

由于小兒膠質瘤惡性細胞中BDNF受體TrkB呈高表達，但卻不表達BDNF，說明其中的BDNF來自于外部微環(huán)境。因此，研究者通過缺乏BDNF活性誘導表達的基因工程小鼠模型（Bdnf-TMKI）測試了神經元活性調節(jié)的BDNF分泌到腫瘤微環(huán)境中的作用。研究者在Bdnf-TMKI小鼠的深層皮質投射神經元中表達興奮性藍光門控視蛋白通道rhodopsin-2（圖1a），以實現(xiàn)皮質投射（谷氨酸能）神經元活動的光遺傳刺激。將患者來源的小兒膠質瘤（DIPG）細胞異種移植到額葉皮層和皮層下白質中，在移植5周后，用既定的方案（每天10分鐘，20Hz藍光刺激，30秒開/90秒關周期）刺激皮質投射神經元活動，持續(xù)1周。正如預期的，作者觀察到BDNF野生型小鼠在受刺激后膠質瘤增殖增加。在缺乏BDNF活性調節(jié)的表達和分泌的Bdnf-TMKI小鼠中，皮質投射神經元活性調節(jié)對膠質瘤增殖的影響明顯減弱（圖1b-d）。

鑒于以上結果，研究者接下來探討了神經活性調節(jié)的BDNF對BDNF野生型和攜帶DIPG異種移植物Bdnf-TMKI小鼠的存活率影響。結果發(fā)現(xiàn)，神經元活動調節(jié)的BDNF表達和分泌的喪失導致腦干中攜帶患者來源DIPG異種移植物的Bdnf-TMKI小鼠生存優(yōu)勢明顯增加（圖1e），這與活動調節(jié)的BDNF信號在腦微環(huán)境中強烈影響膠質瘤進展的假設一致。

研究表明，BDNF通過TrkB（由NTRK2編碼）受體作用于神經膠質瘤細胞，并且BDNF是兒童神經膠質瘤對其作出反應的關鍵神經營養(yǎng)因子。因此，作者測試了遺傳或藥理學TrkB阻斷對小兒膠質瘤生長的影響。將小鼠與患者來源的細胞原位異種移植。與移植了NTRK2野生型細胞的對照組相比，移植了腦干NTRK2-KO DIPG或額葉皮層NTRK2-KO兒科皮質膠質母細胞瘤的小鼠的總體存活率顯著增加（圖1f）。使用抑制劑治療侵襲性患者源性小兒膠質瘤（DIPG）原位異種移植模型可提高總生存率（圖1g）。說明抑制劑對DIPG的作用機制是通過TrkB介導的。

后期作者通過將神經元與NTRK2野生型或NTRK2-KO膠質瘤細胞共培養(yǎng)來研究BDNF-TrkB信號傳導在神經元-膠質瘤相互作用中的相對貢獻。結果表明，在缺乏神經元的情況下，TrkB損失并不會降低小兒膠質瘤細胞的增殖（圖1i）。與神經元共培養(yǎng)相比，BDNF配體單獨作用下TrkB損失引起的膠質瘤增殖變化的程度（圖1h，i）。表明BDNF在神經元-膠質瘤相互作用中可能具有更復雜的作用，而不僅僅是作為一種活性調節(jié)的生長因子。

在兒童和成人膠質瘤中，谷氨酸能神經元到膠質瘤突觸是由鈣滲透性AMPARs介導的，并能有效調節(jié)膠質瘤的進展。在健康的大腦中，BDNF-TrkB信號通過多個機制調節(jié)谷氨酸能突觸傳遞。接著作者探索了BDNF-TrkB信號在膠質瘤中的促生長作用是否涉及突觸生物學調節(jié)。結果發(fā)現(xiàn)，藥物阻斷AMPARs或通過敲除NTRK2基因阻斷TrkB可降低體內或神經元-膠質瘤共培養(yǎng)中腫瘤細胞的增殖（圖1j-m）。然而，沒有發(fā)現(xiàn)阻斷AMPARs和TrkB的疊加效應，這表明兩者之間存在機制相關性。

圖1. 神經活動調節(jié)的BDNF促進膠質瘤進展

（圖片源自《Nature》）

研究者在急性切片制備中對移植到海馬的膠質瘤細胞進行了全細胞膜片鉗電生理實驗（圖2a）。發(fā)現(xiàn)在切片上灌注BDNF增加了谷氨酸誘發(fā)電流的振幅（圖2b，c）。證實膠質瘤細胞TrkB激活介導谷氨酸誘發(fā)電流振幅的變化。與NTRK2野生型膠質瘤異種移植細胞相比，NTRK2敲除阻止了BDNF誘導的谷氨酸誘發(fā)內向電流振幅的增加（圖2b，c），與BDNF通過CAMKII鈣信號通路調節(jié)突觸強度的假設一致，CAMKII抑制劑KN-93阻斷了BDNF對膠質瘤谷氨酸能電流振幅的影響，而非活性類似物KN-92則沒有（圖2d，e）。這些發(fā)現(xiàn)表明BDNF-TrkB信號通路調節(jié)膠質瘤細胞中谷氨酸誘發(fā)電流的強度。

膠質瘤中的谷氨酸能信號傳導可以是突觸性的，也可以是非突觸性的。為了測試BDNF對神經元到膠質瘤突觸電流的影響，研究者將軸突傳入神經（Schaffer側枝）刺激到植入膠質瘤細胞的海馬CA1區(qū)（圖2f）。暴露于BDNF后，膠質瘤EPSCs的振幅增加（圖2g，h）。這些數據表明，BDNF增加谷氨酸誘發(fā)電流的強度。為了探索BDNF誘導的電流放大對細胞內的影響，研究者對表達基因編碼鈣指示劑GCaMP6s的異種移植膠質瘤細胞進行了原位鈣成像（圖2i）。如預期所示，局部應用谷氨酸可誘導膠質瘤細胞中的鈣瞬變（圖2j-l）。在兩種不同的兒童膠質瘤患者模型中，BDNF暴露增加了谷氨酸誘發(fā)鈣瞬變的強度和持續(xù)時間（圖2i-l）。

圖2. BDNF-TrkB信號傳導增加了膠質瘤細胞中谷氨酸能電流的振幅

（圖片源自《Nature》）

在健康神經元中，BDNF-TrkB信號通過CAMKII鈣信號通路增加AMPARs到突觸后膜的運輸（圖3a）。鑒于上述發(fā)現(xiàn)表明，BDNF增加了膠質瘤中AMPAR介導的電流和鈣瞬態(tài)，研究者下一步研究了BDNF對膠質瘤細胞中AMPAR轉運到細胞膜的影響。膠質瘤細胞表達AMPAR亞基GluA2、GluA3和GluA4，暴露于BDNF后，細胞膜上這些亞基的水平都增加了。為了研究BDNF對GluA4和GluA3亞基的影響，使用抗體捕獲膠質瘤細胞表面蛋白，并探索AMPAR亞基的水平。與BDNF增加AMPAR向膠質瘤細胞膜運輸的假設一致，與載體處理的對照膠質瘤細胞相比，BDNF暴露增加了膠質瘤細胞表面AMPAR亞基GluA3和GluA4的水平（圖3b-e）。

研究者們還生成了一個氟標記的鈣透性異構體（GluA2（Q）） 以檢測GluA2亞基的運輸情況。他們在膠質瘤細胞中表達了RFP標記的PSD95，以確認GluA2在膠質瘤突觸后位點的定位。當亞基的N端從酸性pH值中移動時，熒光蛋白（SEPs）就會發(fā)出熒光將囊泡運輸到細胞膜外的中性pH值（圖3h）。而后他們將表達GluA2（Q）-SEP和PSD95-RFP的膠質瘤細胞暴露于酸性培養(yǎng)基（pH5.5）中發(fā)現(xiàn)會淬滅信號，這表明突觸后點位的AMPAR熒光信號大部分來自質膜結合的GluA2（圖3i，j）。單個光斑的時間過程成像表明，BDNF暴露引起膠質瘤細胞突觸后GluA2水平的增加（圖3k-m），其時間尺度與GluA3和GluA4運輸的增加（圖3b-e）和谷氨酸誘發(fā)電流的變化一致。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明，BDNF-trkb信號傳導增加了AMPAR亞基到細胞膜的運輸，導致了上述谷氨酸誘發(fā)電流的增加。

圖3. BDNF調節(jié)AMPAR到膠質瘤突觸后膜的運輸

（圖片源自《Nature》）

與前人研究結果一致的是，研究者使用膜片鉗電生理學觀察到異種移植的神經膠質瘤細胞的一個子集表現(xiàn)出向內電流以響應谷氨酸，而NTRK2-KO腫瘤顯示對谷氨酸有反應的細胞較少（圖4a，b）。研究者先假設膠質瘤細胞中NTRK2的缺失可能會改變惡性突觸連通性的程度。為了研究BDNF-TrkB信號是否調節(jié)神經元到膠質瘤突觸連接的數量，他們對攜帶表達GFP的野生型和NTRK2-KO患者來源的膠質瘤異種移植小鼠的大腦進行了免疫電鏡觀察。結果發(fā)現(xiàn)NTRK2-KO腫瘤中神經元到膠質瘤的突觸結構比野生型腫瘤少（圖4c，d）。與神經元的共培養(yǎng)結果顯示，同NTRK2野生型膠質瘤細胞相比，NTRK2-KO膠質瘤細胞共培養(yǎng)的突觸結構較少，神經元的突觸前點與膠質瘤突觸后點（PSD95-RFP）共定位（圖4e，f）。在神經元-膠質瘤共培養(yǎng)物中添加TrkB抑制劑也可以觀察到神經元-膠質瘤突觸結構的減少（圖4g）。這些數據表明BDNF-TrkB信號調節(jié)神經元到膠質瘤的突觸連接。

接下來，為了解釋突觸可塑性在膠質瘤生長中的作用，他們又測試了去極化電流的大小是否會差異促進癌細胞增殖。使用光遺傳學策略來模擬不同程度的膠質瘤突觸強度，通過對表達藍光敏感陽離子通道ChR2的患者源性膠質瘤細胞施加不同的藍光脈沖持續(xù)時間（光脈沖寬度）來控制膠質瘤膜-膜去極化的幅度。結果表明，施加5ms或25ms的光脈沖寬度刺激會導致膠質瘤細胞膜的去極化幅度隨著光脈沖的持續(xù)時間而增加（圖4h，i）。表達ChR2的異種膠質瘤移植物體內的去極化顯示，隨著膠質瘤膜去極化程度的增加，膠質瘤增殖率增加（圖4j，k）。綜上所述，這些數據將惡性突觸可塑性與膠質瘤病理生理聯(lián)系起來。

總之，這些發(fā)現(xiàn)表明BDNF-TrkB信號傳導能促進惡性突觸可塑性增強從而推動腫瘤進一步發(fā)展。這一發(fā)現(xiàn)是癌癥神經學的重大突破，為腦膠質瘤治療藥物的開發(fā)以及突觸功能障礙相關疾病的治療奠定了基礎。

圖4. 神經元-膠質瘤連接的可塑性及突觸強度增加對腫瘤性能的影響

（圖片源自《Nature》）

云克隆開發(fā)了上述研究中相關指標的蛋白、抗體、ELISA試劑盒等產品以助力神經腫瘤治療相關研究，部分指標節(jié)選如下，供參考：