Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KARS）是癌癥中最常被激活的癌基因，而KRAS突變體的激活狀態(tài)更是一個難以捉摸的靶標(biāo)。由于它表面光滑，缺乏適合小分子候選藥物的結(jié)合袋，它通常被認(rèn)為是“無成藥性”的。2023年8月，《Science》雜志上發(fā)表了一篇題為“Chemical remodeling of a cellular chaperone to target the active state of mutant KRAS”的文章，在這項研究中，研究者設(shè)計了一種小分子，重塑了親環(huán)蛋白A(CYPA)的表面，形成了一個對KRAS^G12C(甘氨酸-12突變成半胱氨酸)活性態(tài)具有高親和力和選擇性的新形態(tài)界面。由此產(chǎn)生的CYPA:藥物:KRAS^G12C三復(fù)合物在人類多種癌癥模型中能夠阻斷致癌信號并導(dǎo)致腫瘤消退，這種抑制策略可用于靶向其他KRAS突變體和其他不可藥物的癌癥驅(qū)動因子。

研究者注意到CYPA與KRAS效應(yīng)結(jié)合界面上的殘基具有良好的靜電表面電荷互補性。Sanglifehrin A是一種可以高親和力結(jié)合CYPA的天然產(chǎn)物。基于此，他們首先設(shè)計了包含Sanglifehrin A和一個半胱氨酸的化合物1，然后得到原始CYPA：化合物1：KRAS^G12C三復(fù)合物。復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)表明，配體的大環(huán)化會降低構(gòu)象熵，增加蛋白質(zhì)的接觸面積。于是，研究者在化合物1的基礎(chǔ)上進行環(huán)化改造，得到化合物2和化合物3。分子活性測定顯示化合物2誘導(dǎo)的CYPA復(fù)合物與鳥苷-5′-[(β,γ)-酰亞胺基]三磷酸（GMPPNP）結(jié)合的野生型KRAS（KRAS^WT）以及 KRAS^G12C的半抑制濃度（IC50）分別是510 nM、180 nM。相比之下，化合物3誘導(dǎo)CYPA復(fù)合物的效力增加，對KRAS^G12C的IC50為52 nM，同時保持與KRAS^WT的可逆結(jié)合（IC50：520 nM）。

接著，研究者對化合物3進行修飾，得到化合物4，誘導(dǎo)形成的KRAS^G12C-CYPA三復(fù)合物IC50為28 nM。他們又通過進一步優(yōu)化得到化合物RMC-4998，靶向 KRAS^G12C的活性或鳥苷三磷酸（GTP）結(jié)合狀態(tài)。實驗數(shù)據(jù)也表明，RMC-4998能可逆地綁定到CYPA上形成低親和力二元復(fù)合物，并且重塑了CYPA的分子表面，使其能特異性結(jié)合KRAS^G12C。（見圖1）

研究人員發(fā)現(xiàn)在三復(fù)合物中，CYPA阻斷了KRAS^G12C的效應(yīng)結(jié)合界面，CYPA：RMC-4998：KRAS^G12C三復(fù)合物的形成會導(dǎo)致BRAF RBD（B-Raf原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，RAS蛋白結(jié)合區(qū)）和RALGDS RID（鳥嘌呤核苷酸解離刺激物，RAS交互域）從突變KRAS中濃度依賴性解離。在活細(xì)胞動力學(xué)測定中，RMC-4998處理會導(dǎo)致KRAS^G12C與CYPA快速結(jié)合，同時原癌基因絲蘇氨酸蛋白激酶（CRAF）與KRAS^G12C解離。研究者通過比較CYPA缺失細(xì)胞和正常表達的細(xì)胞中RMC-4998對CYPA結(jié)合活性發(fā)現(xiàn)CYPA對于RMC-4998的抑制作用是必不可少的。

在后續(xù)的突變癌細(xì)胞細(xì)胞實驗中，研究者先用多西環(huán)素（DOX）誘導(dǎo)的KRAS^G12C主鏈cDNA文庫去感染KRAS^G12C突變細(xì)胞，再用二甲基亞砜（DMSO）或RMC-4998 (100 nM)處理2周，證實了KRAS C12、I36和E37殘基的重要性，其他殘基(包括G13、P34和A59)的突變減弱了RMC-4998的作用，可能會破壞開關(guān)區(qū)域的構(gòu)象，以阻止CYPA：RMC-4998與活性KRAS^G12C結(jié)合。通過活細(xì)胞生物傳感器發(fā)現(xiàn)，CYPA上與KRAS^G12C直接接觸的N71、K151和R148殘基上的丙氨酸突變會導(dǎo)致三復(fù)合物解離，KRAS^G12C開關(guān)I上E31A、D33A和E37A的突變也能抑制三復(fù)合物的形成，突出了這些殘基在結(jié)合中的重要性。（見圖2）

在KRAS^G12C突變癌細(xì)胞模型中，RMC-4998與破壞效應(yīng)物結(jié)合，可以抑制下游細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號，IC50范圍在1到10nM之間。與非活性狀態(tài)選擇性抑制劑 adagrasib (1μM)和sotorasib (10μM)相比，RMC-4998(0.1μM)靶向KRAS^G12C的GTP結(jié)合狀態(tài)，可以更快地破壞KRAS^G12C與CRAF之間的相互作用。

研究者發(fā)現(xiàn)非活性狀態(tài)選擇性抑制劑的一個限制是KRAS^G12C水解GTP的速度，RMC-4998通過直接靶向其活性狀態(tài)克服了這一限制；另一個限制是它們對細(xì)胞刺激的敏感性，細(xì)胞刺激驅(qū)動核苷酸交換，誘導(dǎo)KRAS^G12C的GTP負(fù)載，這在受體酪氨酸激酶(RTK)激活后尤為明顯。暴露于表皮生長因子(EGF)或肝細(xì)胞生長因子(HGF)會導(dǎo)致非活性狀態(tài)選擇性抑制劑adagrasib的靶標(biāo)接觸減弱，以及ERK抑制和抗增殖作用減弱。（見圖3）  

隨后，研究人員對RMC-4998進一步優(yōu)化，得到RMC-6291。在腫瘤細(xì)胞系中，RMC-4998和RMC-6291均能抑制KRAS^G12C突變細(xì)胞中ERK信號的傳導(dǎo)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但RMC-6291抑制KRAS^G12C突變體細(xì)胞增殖的能力更強，相比而言選擇性指數(shù)高。攜帶異種移植的小鼠每日口服RMC-6291表現(xiàn)出良好的耐藥性，且其腫瘤幾乎完全消退。

接著，研究者評估了RMC-6291對腫瘤DUSP6 mRNA表達的影響，發(fā)現(xiàn)RMC-6291抑制作用具有劑量依賴性。研究者用RMC-6291處理KRAS^G12C突變體（NSCLC）或結(jié)直腸癌（CRC)異種移植模型小鼠。處理28天后，RMC-6291導(dǎo)致76%(19/25)的NSCLC模型和40%(6/15)的CRC模型平均腫瘤消退。這些結(jié)果表明，在臨床前研究中，RMC- 6291每日口服后可以驅(qū)動深度抗腫瘤反應(yīng)。（見圖4）

總的來說，這些發(fā)現(xiàn)說明RMC-4998和RMC-6291抑制劑靶向激活狀態(tài)KARS，代表了一種免疫親和蛋白結(jié)合天然產(chǎn)物的成功重組，臨床前數(shù)據(jù)也表現(xiàn)出很好的選擇性和抗腫瘤活性，這種三復(fù)體抑制策略對癌癥治療具有廣泛的意義。

云克隆開發(fā)了上述研究中涉及的相關(guān)指標(biāo)的蛋白、抗體、ELISA試劑盒等產(chǎn)品以助力腫瘤治療相關(guān)研究，部分指標(biāo)節(jié)選如下，供參考：